Сообщение
=Olesik=
15 ноя 2009, 21:27
Роль антигенов II класса главного комплекса гистосовместимости в привычном невынашивании беременности
Т. С. Бескоровайная Н. В. Полтавец Е. А. Близнец Н. Н. Вассерман С. М. Тверская А. В. Поляков
В группе фертильных супружеских пар (n=50) и пар с привычным невынашиванием беременности (n=29) проведено типирование супругов по трем локусам HLA II класса (DQA1, DQB1, DRB1). Выявлено статистически значимое увеличение числа пар, в которых супруги совпадают по двум или трем локусам HLA II класса, по сравнению с контрольной группой. У мужчин и женщин из группы с ПНБ выявлено изменение частот аллелей, генотипов и гаплотипов в локусах HLA II класса по сравнению с контрольной группой. Обнаружены также различия в числе пар, в которых супруги совпадали по определенным аллелям и гаплотип
________________________________________
Быстро развивающиеся технологии ЭКО помогают решать репродуктивные проблемы, однако некоторые генетические аспекты остаются за рамками внимания врачей, что иногда не позволяет достигать желаемого результата. Среди различных типов репродуктивных нарушений привычное невынашивание беременности (ПНБ) наблюдается у 1-2% женщин и, зачастую, при клиническом обследовании пациентки не удается выявить его причину [25].Причиной ПНБ могут быть анатомические аномалии, гормональные нарушения, генетические/хромосомные дефекты, патология системы гемостаза и иммунной системы, инфекции и др. [8, 18, 26, 33]. Кроме того, на развитие беременности важное влияние оказывает воздействие различных неблагоприятных факторов окружающей среды: тяжелых металлов (ртуть, свинец), органических соединений, ионизирующего излучения, стрессовых факторов [24, 29]. Распространенность перечисленных нарушений до конца не ясна, а причины данной патологии выявляются только в 50% случаев [8, 15, 23, 31].Одной из причин ПНБ в I триместре беременности является нарушение в иммунной системе матери. Наблюдаются изменения как клеточного, так и гуморального звена иммунного ответа.Система генов тканевой совместимости человека (Human Leukocyte Antygen - HLA) является одной из наиболее полиморфных генетических систем, выполняющей в организме человека ряд функций. Важнейшими из них являются генетический контроль иммунного ответа и поддержание иммунного гомеостаза, нарушение которых лежит в основе таких патологических процессов, как аутоиммунные заболевания и развитие опухолей [1].Эмбрион млекопитающих, зигота, возникающий в результате слияния генетического материала двух гамет, обычно в значительной степени отличается генетически от материнского организма и обладает антигенами отцовского происхождения. Полагали, что избежать отторжения эмбриону помогает абсолютная неиммуногенность клеток трофобласта. Позже было показано, что оплодотворенное яйцо, как и сперматозоид, имеет на своей поверхности различные антигены отцовского происхождения [12]. Антигенный состав в основном представлен антигенами II класса гистосовместимости (HLA DRB1, DQA1, DQB1), так как большинство антигенов I класса (HLAA, HLAB, HLAC) не экспрессируется на поверхности синцитиотрофобласта. Эта «чужеродность» является нормальным физиологическим явлением, запускающим особые иммунные реакции, направленные на сохранение беременности. Пролиферируя, клетки трофобласта внедряются в кровоток матери, происходит контакт антигенов плода с Т-лимфоцитами матери. Далее осуществляется выработка специальных «защитных» антиотцовских аллоантител (АРСА - antipaternal cytotoxic antibodies, Ab2-anti-anti HLA antibodies, MLR-Bf - mixed lymphocyte reaction blocking factor), которые покрывают поверхность клеток трофобласта и играют важную роль в успешном развитии беременности [13, 19, 22]. Также при стимуляции антигенами эмбриона происходит ингибирование цитотоксичности NK-клеток (естественных киллеров) децидуальной оболочки, что необходимо для имплантации эмбриона и развития васкуляризации плаценты [4].По данным ряда исследований, полное несовпадение HLA-генотипов у супругов благоприятно для развития беременности [5, 9, 30]. В супружеских парах с ПНБ неясного генеза было отмечено, что одинаковые антигены в HLA-генотипах встречаются чаще по сравнению с теми парами, где беременность развивается нормально. Большое число совпадающих антигенов HLA II класса у супругов приводит к тому, что не происходит достаточной иммуностимуляции организма матери, и она не вырабатывает необходимого количества аллоантител к антигенам эмбриона. Возможно также развитие аутоиммунной реакции матери, приводящей к выработке антифосфолипидных, антинуклеарных, антитиреоидных и других антител, повреждающих плаценту [6, 11, 34]. Также у женщин с ПНБ, у которых совпадают с мужем аллели HLA-DQ и DR, наблюдается повышение цитотоксичности и количества NK-клеток. Эмбрион не распознается как плод, а воспринимается как измененная клетка собственного организма, против которой начинает работать иммунная система. Это приводит к развитию некроза в области децидуальной оболочки и трофобласта и раннему прерыванию кариотипически нормальной беременности. Таким образом, несовместимость супругов по HLA-антигенам и отличие зародыша от материнского организма являются важным моментом, необходимым для сохранения и вынашивания беременности.Отмечено увеличение частоты определенных аллелей HLA II класса и HLA-гаплотипов как у женщин с ПНБ, так и у мужчин, чьи жены имели несколько самопроизвольных абортов [17, 28, 32]. Высказано предположение о том, что именно наличие определенных аллельных вариантов и их сочетаний оказывает решающую роль на ход развития иммунной реакции во время беременности. Кроме того, установлено, что определенные аллели и гаплотипы HLA II класса могут нарушать процесс сперматогенеза у мужчин и влиять на качество гамет, что впоследствии может сказаться на полноценности эмбриона.Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей генотипов супругов по HLA-антигенам II класса и распределение различных аллелей и гаплотипов у супружеских пар с ПНБ ранних сроков и у здоровых супружеских пар, а также определение их вклада в патогенез ПНБ.Материал и методыРабота выполнена на 58 образцах крови (29 супружеских пар) пациентов с ПНБ на сроках до 12 нед, обратившихся в Медико-генетический научный центр и медико-генетические консультации Калининграда и Владикавказа, и на 100 образцах крови здоровых доноров из центрального региона России (50 фертильных супружеских пар, имеющих как минимум одного родного ребенка). Женщины из группы с ПНБ имели в анамнезе не менее двух случаев спонтанного аборта или неразвивающейся беременности в I триместре. Большинству пациентов из группы с ПНБ было проведено кариотипирование, которое не выявило каких-либо грубых хромосомных аномалий. Супруги не являлись родственниками. Также в этих парах был исключен резус-конфликт и анатомические аномалии половой системы.Образцы ДНК получали из лимфоцитов периферической крови, используя набор реагентов и протокол для выделения ДНК из различного биологического материала фирмы DIAtomTM DNAPrep100 (Россия). Далее на полученных образцах проводили аллельспецифическую ПЦР трех локусов HLA II класса: DRB1, DQA1, DQB1 с использованием набора реактивов «ДНК-технологии», а также с собственной разработанной системы пар праймеров. Данная система позволяет выделить группы аллелей в локусе DRB1: 01*, 03*, 04*, 06*, 07*, 08*, 09*, 10*, 11*, 12*, 15*, 16*; аллели и группы аллелей в локусе DQA1: 0101*/0104*/0105, 0102*/0106, 0103, 0201, 030*, 0401, 050*, 0601*; в локусе DQB1: 020*, 03010*/0309/0310/0313, 03020*/0307/0308/0311, 03030*/0306/0312, 0304, 03050*, 040*, 05010*, 05020*/0504, 05030*, 06010*, 0602-18/20 (* помечены неразделяемые группы аллелей). Несмотря на то что методически идет выявление группы аллелей, далее в тексте мы будем обозначать группу по первому аллелю из этой группы. После амплификации продукты реакции анализировали в 7% полиакриламидном геле с последующей окраской в растворе бромида этидия (конечная концентрация 0,1 мкг/мл) и визуализацией в проходящем УФ-свете при длине волны 312 нм.Статистический анализ проводили с использованием критерия c2. В случае малой численности или отсутствия каких-либо генотипов/гаплотипов или аллелей для проверки достоверности был применен точный критерий Фишера. Оценки относительного риска проводились по величине соотношения шансов (ORs) [3].Результаты и обсуждениеВ изученных группах был проведен анализ количества совпадений аллелей в супружеских парах в локусах DRB1, DQA1, DQB1 (табл. 1 ).В предыдущей работе мы наблюдали увеличение числа пар с ПНБ, в которых супруги совпадают по двум или трем локусам HLA, однако из-за недостаточного размера изучаемых групп достоверных различий не получено [2]. В настоящем исследовании на более крупных выборках в группе ПНБ нами было выявлено статистически значимое увеличение числа пар, где супруги имеют общие аллели в трех локусах HLA II класса по сравнению с контрольной группой (р=0,044). В выборках также были определены частоты совпадений по каждому отдельному локусу DQA1, DQB1 и DRB1 и по двум из трех возможных. При изучении одного локуса отличий в частотах от контрольной группы не обнаружено. Однако при попарном рассмотрении указанных локусов выявлены статистически значимые различия (табл. 2 ).Таким образом, пар, совпадающих по аллелям в локусах DQA1 и DQB1, а также в локусах DQA1 и DRB1, больше, чем пар, совпадающих в локусах DQB1 и DRB1, что, вероятно, объясняется расположением этих локусов на хромосоме и наличием между ними более тесного сцепления (рис. 1 ). Причем все пары, которые имеют общие аллели в локусах DQB1 и DRB1, совпадают и по локусу DQA1, что в данном случае указывает на наличие жесткого сцепления между определенными аллелями в трех локусах.Процессы иммунной регуляции являются очень сложными. В изучаемых семьях, вероятно, действовали дополнительные факторы, например, такие как уровень синтеза различных гормонов (релаксина, гормона роста плаценты, прогестерона), также сказывающихся на развитии иммунной реакции. Кроме того, система HLA - не единственный фактор, влияющий на протекание беременности и приводящий к ПНБ. Установлено действие других систем (гемостаза, фолатного обмена, детоксикации), изменение в которых может негативно сказываться на развитии беременности [7, 27, 35]. Для оценки влияния совпадений аллелей в локусах HLA II класса нами было проведено HLA-типирование образцов ДНК одиннадцати детей из 10 семей контрольной группы, в которых супруги совпадали по аллелям всех трех локусов. Установлено, что только в 4 (36,4%) случаях (в 3 семьях) дети имели такой же HLA-генотип, как и мать. В остальных 7 (63,6%) семьях дети получили от матери и отца хромосому с совпадающим HLA-гаплотипом или хромосому отца, отличающуюся от материнской по HLA аллелям, и, таким образом, генотип детей по локусам HLA II класса был отличен от материнского (рис. 2 ). Количество детей с таким же HLA-генотипом, как и у матери не отклонялось от ожидаемой величины 1/4. К сожалению, абортивный материал из группы ПНБ не был доступен для исследования. Наличие в контрольной выборке детей, у которых совпадают с матерью HLA-генотипы, показывает, что влияния одного этого негативного фактора оказалось недостаточным для прерывания беременности и что в этой группе могли действовать дополнительные факторы, способствовавшие развитию беременности. Установлено также, что пары из контрольной группы, в которых супруги совпадали по трем локусам HLA II класса отличались по аллельному составу от таких же пар с ПНБ, что будет обсуждено далее.Так как, по данным ряда авторов, в группах с репродуктивными нарушениями отмечается увеличение и уменьшение частоты определенных аллелей HLA II класса, в изучаемых группах нами была оценена частота встречаемости аллелей в локусах DRB1, DQA1 и DQB1 (табл. 3 ). У мужчин из группы с ПНБ было отмечено статистически достоверное увеличение частоты встречаемости аллеля 0302 по локусу DQB1 по сравнению с контрольной группой (р=0,005). Также было выявлено некоторое увеличение частоты встречаемости аллеля 0301 в локусе DQA1 и снижение частоты аллеля 03 в локусе DRB1 по сравнению с мужчинами из фертильных пар. Уменьшение содержания аллеля 03 DRB1 было также отмечено в исследованиях K. van der Ven и соавт. у мужчин из пар с ПНБ и трубным фактором бесплодия [14].Ни у одной женщины с ПНБ не было выявлено аллеля 0303 в локусе DQB1, в контрольной же группе частота этого аллеля составила 6% (р=0,086). В группе ПНБ наблюдали также некоторое увеличение частоты встречаемости аллеля 07 локуса DRB1 и аллеля 0602 локуса DQB1 по сравнению со здоровыми женщинами (см. табл. 3).Исходя из полученных результатов, можно предположить, что аллели группы 030* локуса DQB1, группы 03 локуса DRB1 у мужчин, а также 07 локуса DRB1 и 0602 локуса DQB1 у женщин играют немаловажную роль в формировании иммунного ответа при зачатии и беременности ранних сроков. Причем некоторые из этих аллелей могут предрасполагать к развитию ПНБ (07 DRB1, 0302 DQB1, 0602 DQB1), а некоторые иметь протективный характер (03 DRB1, 0303 DQB1).Значительные различия были обнаружены нами и при изучении генотипов по трем локусам HLA II класса в этих группах. У 10,3% мужчин из группы ПНБ в локусе DRB1 встретился генотип 06/15, в контрольной группе такой генотип не выявлен (р=0,046, OR=13,3 CI - 95%: 1,5-119,1). И, наоборот, у мужчин из фертильных пар частыми оказались генотипы 15/15 в локусе DRB1, 0301/0301 и 0301/0303 в локусе DQB1, тогда как у мужчин из группы ПНБ такие генотипы не были обнаружены. Генотип 0501/0501 в локусе DQA1 также был более частым у мужчин их фертильных пар (рис. 3 ).У женщин с ПНБ по некоторым генотипам наблюдались схожие с мужчинами изменения в распределении частот генотипов в этих трех локусах (рис. 4 ).В группе с ПНБ у женщин достоверно чаще по сравнению с женщинами из контрольной группы встретились генотипы 0101/0501 в локусе DQA1 (р=0,015, OR=5,4 CI - 95%: 1,6-18,4) и 0201/0602 в локусе DQB1 (р=0,023, OR=7,4 CI - 95%: 1,5-36,4). Для аллелей 0201 и 0602 показана ассоциация с системной красной волчанкой. Поэтому наличие одного из этих аллелей, а тем более их сочетания может являться фактором риска прерывания беременности из-за развития аутоиммунных процессов, вследствие чего у женщин, несущих эти аллели, необходимо определять титр аутоантител (в частности, наличие волчаночного антикоагулянта) для своевременного назначения терапии. Также у женщин с репродуктивной патологией отмечено некоторое увеличение частоты генотипов 01/11 в локусе DRB1 и 0501/0301 в локусе DQB1. Как и у мужчин, у женщин из группы ПНБ генотип 06/15 в локусе DRB1 оказался более частым по сравнению с контролем, а генотипы 06/15 DRB1 и 0501/0501 DQA1 не встретились вообще.При рассмотрении генотипов, по которым выявлены общие тенденции в изменении частот суммарно у мужчин и у женщин в изучаемых группах, различия усиливаются и достигают уровня статистической значимости (табл. 4 ). Однако по генотипу 0201/0602 в локусе DQB1 при изучении его частоты во всей группе различия исчезают (р=0,384), что указывает на влияние этого генотипа в развитии патологии только у женщин.Из полученных результатов видно, что изучаемые группы имеют значительные различия в частоте встречаемости некоторых генотипов, из чего можно предположить, что не только определенный аллель, но и сочетание аллелей в локусе может оказывать влияние на репродуктивные функции и общий статус родительского организма. Причем роль некоторых генотипов может быть одинакова как у мужчин, так и у женщин, другие же, как например, в случае генотипов 0101/0501 в локусе DQА1, 0201/0602 в локусе DQB1 и 06/15 в локусе DRB1, могут иметь большее влияние или у женщин или у мужчин.Исследования роли HLA в регуляции репродуктивных процессов у животных и у человека показали, что, возможно, существует не только иммунологическое воздействие системы главного комплекса гистосовместимости на развитие беременности, но и некоторая генетическая основа в нарушении данных процессов, т.е. другой фактор, влияющий на развитие ПНБ, локализованный на этой же хромосоме. У мышей МНС (major histocompatibility complex, аналог HLA у человека) находится на хромосоме 17. Для них было установлено существование летальных или полулетальных генов (Т-комплекс), локализованных внутри или на близком расстоянии от МНС комплекса, вовлеченных в регуляцию процессов раннего развития и дифференцировки, а также созревания гамет. В этой области часто происходят процессы рекомбинации, в результате которых образуются особые фенотипы, ассоциированные со снижением фертильности у особей мужского пола и аномалиями эмбрионального развития (задержка и пороки развития). Гомозиготность же по рецессивным леталям ведет к ранней гибели эмбрионов и спонтанному прерыванию беременности. Наличие подобных генов предполагается и у человека. Так, недавно внутри Т-комплекса у мышей и на дистальном конце короткого плеча хромосомы 6 у человека были открыты несколько генов цинковых пальцев, участвующих в связывании ДНК и инициации процессов транскрипции. Делеции в этих генах ассоциированы с леталями у мышей [16]. У супружеских пар с бесплодием недавно было установлено, что совпадение супругов по аллелям или гаплотипам HLA приводит к гомозиготности эмбриона по таким летальным генам и может вызывать его гибель [20, 21]. Поэтому в изучаемых группах нами были проанализированы гаплотипы у мужчин и у женщин, а также совпадение определенных аллелей и гаплотипов в локусах HLA II класса у супругов.В контрольной группе было выявлено большее разнообразие гаплотипов и у мужчин и у женщин (25 и 23 соответственно) по сравнению с пациентами из группы ПНБ (17 и 16 соответственно). Это может объясняться различием размеров выборок. В то же время по некоторым гаплотипам в группе ПНБ наблюдали жесткое сцепление двух локусов с определенным аллелем в третьем локусе, тогда как у индивидов в контрольной группе в третьем локусе могли находиться разные аллели. Также было обнаружено расхождение в частоте некоторых гаплотипов в изучаемых группах. При рассмотрении гаплотипов по трем локусам DRB1-DQA1-DQB1, у мужчин из группы ПНБ было выявлено статистически достоверное увеличение частоты гаплотипа 04-0301-0302 по сравнению с контрольной группой (р=0,013, OR=5,7 CI - 95%: 1,6-21,1), а также некоторое снижение содержания в этой группе гаплотипа 03-0501-0201. При анализе сочетаний по двум локусам частота гаплотипа DQA1-DQB1 0301-0302 у мужчин из выборки с ПНБ оказалась еще более высокой по сравнению с таковой у мужчин из фертильных пар (р=0,005, OR=6,6 CI - 95%: 1,9-23,5), хотя частота гаплотипа DRB1-DQA1 04-0301 у мужчин из обеих групп была практически одинакова. Это указывает на важность именно аллеля 0302 локуса DQB1 в развитии репродуктивной патологии (рис. 5 ). Также возможно, что с гаплотипом 04-0301-0302 сцеплен какой-то другой фактор, влияющий на развитие ПНБ.У женщин с ПНБ было выявлено статистически значимое увеличение частоты гаплотипа DRB1-DQA1-DQB1 07-0201-0201 (р=0,041, OR=2,6 CI - 95%: 1,0-6,8). Гаплотипы 07-0201-0303 и 03-0501-0201 отсутствовали в группе с ПНБ, тогда как у женщин из контрольной группы их частота составила по 5% (рис. 6 ). При рассмотрении двух локусов DQA1-DQB1 у женщин с ПНБ отмечено также повышенное содержание гаплотипа 0201-0201 по сравнению с фертильными женщинами (р=0,041, OR=2,6 CI - 95%: 1,0-6,8), а по частоте гаплотипа DRB1-DQA1 07-0201 группы имели близкие значения. Как и в случае мужчин, сцепление с определенным аллелем в третьем локусе, а именно с аллелем 0201 в локусе DQB1, может указывать на наличие дополнительного фактора на этой хромосоме, оказывающего неблагоприятное влияние на репродуктивную функцию. Статистически значимые различия были также обнаружены для гаплотипа DQA1-DQB1 0501-0201, частота которого у женщин из контрольной группы составила 7%, а в группе с ПНБ такой гаплотип не встретился (р=0,048, OR=0,1 CI - 95%: 0,01-0,9).При изучении совпадения аллелей и гаплотипов в парах было установлено, что 20,7% пар из ПНБ и только 6% - в контрольной группе совпадают по аллелю 07 локуса DRB1 (р=0,068, OR=3,8 CI - 95%: 1,0-13,9). Близкие к статистической значимости расхождения в наличии общих гаплотипов в паре были получены только для гаплотипа DQA1-DQB1 0102-0602, по которому совпадали 17,2% пар в группе с ПНБ и 4% пар в контрольной группе (р=0,093, OR=4,4 CI - 95%: 1,0-18,5). Значительных изменений в частоте совпадений супругов по определенным генотипам не обнаружено. Отсутствие достоверных различий в изучаемых группах может объясняться незначительным вкладом леталей в развитие ПНБ в этих парах.Возможно, что патологическое влияние определенных аллелей HLA усиливается при совпадении супругов по большому числу локусов. Нами были отдельно рассмотрены частоты аллелей, генотипов и гаплотипов в 14 парах из группы с ПНБ и в 13 фертильных парах, в которых супруги совпадают по трем локусам HLA II класса, для определения того, сохраняются ли выявленные тенденции в данных подгруппах. Установлено, что частота аллеля 03 локуса DRB1 (и в связи со сцеплением гаплотипа 03-0501-0201) у мужчин из контрольной группы составила 15,3%, а в подгруппе ПНБ этот аллель не встретился (р=0,047), причем различие частот достигло статистической достоверности в отличие от частот в целом по группам (табл. 5 ). У мужчин из пар с ПНБ также отмечено некоторое увеличение частоты аллеля 07 в локусе DRB1, 0301 в локусах DQA1 и DQB1 и 0302 в локусе DQB1 по сравнению с мужчинами из фертильных пар. Выявленные изменения сохранились также и в подгруппе женщин с ПНБ, у которых аллель 0602 локуса DQB1 встретился чаще по сравнению со здоровыми женщинами, причем различие частот опять увеличилось и приблизилось к статистической значимости (28,6 и 7,7% соответственно, р=0,079; OR=4,1 CI - 95%: 1,0-16,4). Повышение количества аллелей из группы 0602 локуса DQB1 также описано в литературе, что подчеркивает их особое значение в оказании негативного влияния на течение беременности [32]. У женщин с ПНБ было также отмечено некоторое увеличение частоты аллеля 06 в гене DRB1 по сравнению с таковой у женщин из контрольной группы.Изменений в частотах генотипов в отобранных парах, в которых супруги имеют общие аллели в трех локусах, выявлено не было. Также не обнаружено различий в совпадении супругов по генотипам и гаплотипам, что, видимо, может быть следствием малого размера выделенных подгрупп, хотя выявленные тенденции для всей группы целиком в этих в выборках сохраняются. Для подтверждения выявленных различий необходимо расширение исследуемых групп.Роль HLA антигенов в репродукции человека остается спорным вопросом. Процессы иммунной регуляции являются сложными и недостаточно изученными. Нарушение в каждом звене может приводить к той или иной форме репродуктивной патологии. Кроме того, возможно действие дополнительных факторов, сказывающихся на развитии иммунной реакции.Нами выявлены значительные различия в частотах некоторых аллелей, генотипов и гаплотипов у мужчин и у женщин из пар с ПНБ и в группе фертильных пар. Это может указывать на негативное влияние как самих аллелей на развитие беременности, так и генов, возможно ассоциированных с определенным гаплотипом. Так как аллели и гаплотипы «риска» встречаются и в здоровых парах, хотя и со значительно меньшей частотой, то их отрицательное воздействие не абсолютно и возможно наличие дополнительных факторов, вносящих свой вклад в развитие данной патологии. Негативное воздействие может выражаться как в нарушении процессов гаметогенеза и сказываться на «качестве» половых клеток, так и в снижении жизнеспособности самих эмбрионов. В настоящем исследовании выявлено также увеличение числа пар с ПНБ, в которых супруги совпадают по аллелям в нескольких локусах HLA II класса, что подтверждает важность иммунологической стимуляции «чужеродными» антигенами отца организма матери для нормального развития беременности.Дальнейшие исследования и анализ различных аллелей, их сочетаний и гаплотипов могут прояснить механизмы, действующие в патофизиологии привычного невынашивания беременности
Кстати сказать у меня есть еще и старший брат 
Как тебе, такой эксперимент? Если бы я была в таких сомнениях, попросила бы их для меня это сделать. Они для родной дочки не сочтут ведь это за труд? Зато по их результатам будет видно их количество совпадений и к каким-то выводом приведет. Или я как-то может неправильно рассуждаю?))))
