ПЦР (Полимеразная цепная реакция)

ПЦР базируется на принципе естественной репликации ДНК. Сущность метода ПЦР заключается в выделении специфических конкретных участков ДНК с использованием соответствующих праймеров и многократного их воспроизведения (аплификации) при помощи фермента ДНК-полимеразы. Количество фрагментов ДНК при этом увеличивается в геометрической прогрессии. Помимо этого, ПЦР позволяет проводить и другие манипуляции с нуклеиновыми кислотами – производить сращивание фрагментов ДНК, вводить мутации.

Основные принципы использования праймеров для получения копий ДНК были описаны в 1971 году группой авторов во главе с Клеппе - норвежским ученым из лаборатории нобелевского лауреата Кораны. Впервые метод ПЦР был описан в журнале в 1985 году. Так как идея Клеппе была не реализована, то исследования были продолжены другим ученым – Муллисом, который через несколько лет после публикации получил Нобелевскую премию за изобретение метода ПЦР. Первоначальная технология этого метода подразумевала добавление в реакционную смесь ДНК-полимеразы после каждого цикла нагрева и охлаждения. ДНК-полимераза инактивировалась для разделения цепочек спирали ДНК при высокой температуре. На проведение этой процедуры уходило очень много времени, большое количество фермента, но она оставалась малоэффективной. Вскоре было предложено использовать термофильные бактерии для получения ДНК-полимеразы. Открытие уникального фермента ДНК-полимеразы у бактерий (термофильных бактерий) обитающих в гейзерах, позволило сделать метод ПЦР эффективным. Особенность фермента термофильных бактерий - это высокая термостойкость (около 40 минут составляет период полужизни при температуре 95 градусов по Цельсию), возможность использования фермента при высоких рабочих температурах (оптимально использованная рабочая температура 72 градуса по Цельсию).

Метод ПЦР дает возможность размножения одного определенного участка ДНК, создания его многочисленных копий, что делает упрощенным исследование образца ДНК. Репликация ДНК состоит из нескольких стадий: расплетается двойная спираль ДНК – проводится денатурация ДНК, для побуждения к запуску синтеза ДНК образуют короткие двухцепочные участки ДНК. Третья стадия – взаимодополнение, достраивание обеих нитей ДНК – синтез новой цепи. Для процесса ПЦР требуется подбор специфичных праймеров. Если специфичность праймеров будет недостаточна, то в пробирке с реакционной смесью начнутся нежелательные процессы – синтез неспецифической ДНК, состоящей из длинных или коротких фрагментов. Это может помешать правильной оценке результатов исследования. Синтез неспецифической ДНК требует расхода части праймеров и трифосфорного эфира дезоксирибонуклеозида, что влияет на частичную потерю чувствительности. Открытие фермента термофильных бактерий сделало метод ПЦР цикличным и эффективным. Метод ПЦР стал широко внедряться во все сферы жизни человека, ПЦР стали использовать в лабораторной клинической диагностике.

Метод ПЦР широко применяется в диагностике инфекционных заболеваний, возбудителей которых сложно выявить традиционными методами анализа. Так, многие заболевания, передающиеся половым путем (ЗППП) на ранних стадиях протекают бессимптомно; а с помощью ПЦР можно обнаружить минимальное количество возбудителя в исследуемом материале. Метод ПЦР позволяет обнаружить единственную копию чужеродной ДНК в образце.

В случае прямого обнаружения возбудителя болезни метод ПЦР не имеет равных. С помощью иммуноферментного анализа, основанного на выявлении маркеров – белков, которые являются продуктами жизнедеятельности определенных бактерий, возможно предположить наличие инфекции в организме. С помощью метода ПЦР определяется непосредственный возбудитель инфекционного заболевания. Способствует этому выявление специфического участка ДНК возбудителя. Метод ПЦР обладает высокой специфичностью – в образце выявляется фрагмент ДНК, который характерен только для определенного возбудителя болезни. Такая специфичность возможна благодаря заданной нуклеотидной последовательности праймеров. Это полностью исключает получение ложных результатов при исследовании с помощью ПЦР, что нельзя сказать о методе иммуноферментного анализа.

С помощью ПЦР можно обнаружить единичные клетки вируса или бактерии, что ставит метод ПЦР впереди всех других исследований – микроскопических, иммунологических, бактериологических, с помощью которых не всегда удается обнаружить возбудителя. Высокая чувствительность метода позволяет проводить исследования на крошечном количестве образца, получая из него большое количество копий идентичного материала. Метод ПЦР применяют для выявления таких заболеваний, как хламидиоз, микоплазмоз, герпес, уреаплазмоз, гарднереллез и др.

При обнаружении возбудителя выявляется фрагмент его ДНК или РНК. Применяя унифицированные методы лабораторных исследований, добиваются получения результатов о нескольких возбудителях в одной биопробе. Пробы для метода ПЦР готовят, используя нескольких методик – извлекают ДНК из биопробы, нейтрализуют или удаляют различные посторонние примеси, получают ДНК препарат с определенной степенью чистоты, пригодной для проведения процесса полимеразной цепной реакции. Для проведения ПЦР готовится реакционная смесь, в которую вносится препарат ДНК, подготовленный для анализа, учитывая особенности отжига праймеров. Повышенный расход праймеров может привести к потере чувствительности системы, а это сделает чтение результатов реакции при электрофорезе невозможным.

Для анализа методом ПЦР берут кровь, мочу, слюну, мокроту, соскобы (мазки) со слизистой уретры и цервикального канала. Образцы крови для ПЦР следует сдавать натощак; мазок для ПЦР берется не менее чем через сутки после полового акта.

ПЦР-анализ не требует длительного времени для выращивания культуры возбудителя болезни. Высокоэффективный метод позволяет провести полный анализ на биопробе за 4,5 часа. Высокая эффективность метода доказана при проведении диагностики персистирующих форм микроорганизмов, некультивируемых и трудно культивируемых микроорганизмов, незаменим метод в диагностике внутриклеточных паразитов и возбудителей с высокой антигенной изменчивостью.

Методом ПЦР возможно выявление возбудителей болезней не только в биопробе, полученной от больного, но и в материалах внешней среды. Возможно выявление возбудителя в почве, воде и других образцах.

Преимущества ПЦР:

• для анализа методом ПЦР пригоден абсолютно любой биологический материал;
• специфичность ПЦР равна 100% (при правильном выполнении ПЦР ложноположительный результат невозможен);
• высокая чувствительность (ПЦР позволяет выявить от нескольких копий до одного возбудителя в образце);
• одновременно можно выявить несколько возбудителей в одном образце;
• динамика численности возбудителя заболевания (ПЦР позволяет определять количество копий возбудителя в образце, что позволяет оценить эффективность проводимой терапии);
• процесс полностью автоматизирован и результат ПЦР можно получить через несколько часов после начала исследования.

Недостатки метода полимеразной цепной реакции:

• К появлению ложноположительных результатов может привести перекрестная контаминация от пробы к пробе (загрязнение исходного материала во время проведения процесса). Происходит это во время раскапывания реакционной смеси, обработки клинических образцов. При проведении «гнездного» метода используются две пары праймеров – внутренняя и внешняя. После того как использована первая пара праймеров (внешняя), продукт амплификации переносят в пробирку с другой парой праймеров (внутренней). Иногда используют процесс реамплификации вместо «гнездного» - проводят дополнительный цикл амплификации, в котором опять используют прежнюю пару праймеров, а ДНК-мишенью служит продукт первой реакции ампфликации. В этом случае требуется идеальное обустройство лаборатории для того, чтобы избежать контаминации продуктами реакции внешней пары.
• Во время проведения ПЦР происходит накапливание ампликонов, которые являются продуктами для реамплификации. Загрязнение ампликонами лабораторного оборудования, одежды и рук исследователей может привести к появлению ложноположительных результатов. Организация лаборатории – вложение определенных затрат и времени, обучение сотрудников, создание определенных правил и требований, позволит избежать возможности контаминации и получения неверных результатов анализов.

С помощью метода полимеразной цепной реакции можно диагностировать:

• Лимфомы и лейкемию
• ВИЧ-инфекцию
• Гепатит А, В, С
• Рак молочных желез
• Другие онкологические заболевания
• Инфекционные заболевания
• Патогены в пище и воде
• Генетические заболевания

Метод ПЦР не пропускает ни одного инфекционного возбудителя, позволяет выявить инфекционного агента в минимальной пробе из нескольких молекул. Метод позволяет найти среди нормальных клеток (в количестве от 100000 до 1000000) одну аномальную последовательность.

Другое применение метода полимеразной цепной реакции:

• Идентификация личности
• Использование в криминалистике и судебной медицине
• Применение при трансплантации тканей и органов
• Определение отцовства